Show simple item record

dc.contributor.advisorYURTER, Hayat
dc.contributor.authorKOYUNOĞLU, Dila
dc.date.accessioned2019-08-22T10:44:26Z
dc.date.issued2019
dc.date.submitted2019-07-30
dc.identifier.citationKoyunoğlu, D., "Survival Motor Nöron" Proteini Eksikliğinin Mikrotübül Pozitif Uç Proteinleri Üzerindeki Etkisinin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Ensitütüsü, Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019.tr_TR
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11655/8665
dc.description.abstractSpinal muscular atrophy (SMA) is one of the hereditary neuromuscular disease, which is caused by mutations in the Survival of motor neuron 1 (SMN1) gene. SMN deficiency primarily affects motor neurons and regulation of microtubule dynamics and its stability is important for differentiation and functions of neuronal cells. Loss of SMN causes alterations in microtubule polymerization, however, the molecular mechanisms are largely unknown. Microtubule cytoskeleton plays role in establishment of dendrite and axon morphology as well as mRNA, protein and organelle transport to axonal terminals in neurons. Microtubule stability is regulated by both microtubule-associated proteins (MAPs) and plus-end tracking proteins (+ TIPs), which localizes plus-end of microtubules. Among + TIPs, End Binding Protein 1 (EB1) and EB3 proteins bind to tubulins in plus ends and form a molecular platform for the interation of other + TIP proteins. MAP1B, a microtubule-associated protein, binds to EB proteins and prevents their binding to microtubule plus ends by keeping them into cytoplasm. Previously we showed that SMN deficiency causes MAP1B upregulation. Therefore, in this study we investigated whether expressions and/or localizations of EB1 and EB3 proteins are altered in motor neuron like NSC34 cell line. To establish in vitro SMA model, SMN was knocked-down by siRNA, then EB1 and EB3 protein levels were analyzed by Western blot. We found that EB1 is not endogenously expressed in NSC34 cells. In addition, we determined 44% downregulation in EB3 protein level in SMN depleted cells. To analyze localization of EB3 proteins at the begining and tip of neurites, immunofluorescence stainings were performed in SMN knock-down cells. Increased number of comets, as well as decreased comet area was found at the begining of neurites in SMN depleted cells compared to controls. We did not find significant alterations neither in total comet area nor floresean intensities of comets and also total EB3 proteins. Our results suggested that microtubules at the begining of neurites are more dynamic in the absence of SMN and EB3 proteins may be involved in SMA pathomechanisms. Further studies will help to explain the role of SMN protein in microtubule dynamics.tr_TR
dc.description.sponsorshipHacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimitr_TR
dc.description.tableofcontentsONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiv TABLOLAR xvi 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Spinal Müsküler Atrofi’nin Moleküler Biyolojik Özellikleri 3 2.2. Hücre İskeleti 4 2.3. Mikrotübüllerin Yapısı ve Organizasyonu 5 2.4. Mikrotübül Dinamiğini Düzenleyen Proteinler 7 2.5. Pozitif Uç proteinleri (+TIP) 8 2.6. EB Proteinleri 8 3.GEREÇLER VE YÖNTEMLER 15 3.1. Gereçler 15 3.1.1. NSC34 Hücre Hattında SMN Gen İfadesinin Baskılanması 15 3.1.2. Protein İzolasyonu ve Miktar Tayini 16 3.1.3. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi 16 3.1.4. Western Blot 18 3.1.5. İmmünfloresan Boyama 22 3.2. Yöntemler 24 3.2.1. NSC34 Hücre Hattında SMN Gen İfadesinin Baskılanması 24 3.2.2. Protein İzolasyonu ve Miktar Tayini 25 3.2.3. Western Blot Yöntemi 26 3.2.4. İmmünfloresan Boyama Yöntemi 28 3.2.5. Floresan Yoğunluk (Intensity) Analizi 29 3.2.6. Komet Analizi 29 3.2.7. Verilerin Değerlendirilmesi ve İstatistiksel Analizler 30 4. BULGULAR 31 4.1. Western Blot Yöntemi ile EB1 ve EB3 Proteinlerinin İfade Analizi 31 4.2. EB3 Yerleşim Analizi 32 4.2.1. EB3 Floresan Yoğunluk (Intensity) Analizi 34 4.2.2. EB3 Komet Analizi 35 4.3. Nörit Uzunluklarının Ölçülmesi 39 4.4. SMN ve MAP1B Gen İfadeleri Baskılanan Hücrelerde EB3 Protein Miktar Analizi 40 5. TARTIŞMA 41 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 45 7. KAYNAKLAR 47 8. EKLER EK-1: Tez çalışması için gerekli Etik Kurul İzni EK-2: Orjinallik Raporu EK-3: Dijital Makbuz 9. ÖZGEÇMİŞtr_TR
dc.language.isoturtr_TR
dc.publisherSağlık Bilimleri Enstitüsütr_TR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccesstr_TR
dc.rightsAttribution-NonCommercial 3.0 United States*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/us/*
dc.subjectSMNtr_TR
dc.subjectmikrotübül
dc.subjectMAP1B
dc.subjectEB1 ve EB3
dc.subject.lcshKonu Başlıkları Listesi::Tıptr_TR
dc.subject.meshMedical Subject Headings::Str_TR
dc.title"Survival Motor Nöron" Proteini Eksikliğinin Mikrotübül Pozitif Uç Proteinleri Üzerindeki Etkisinin Araştırılmasıtr_TR
dc.typemasterThesistr_TR
dc.bolum
dc.description.ozetKalıtsal nöromüsküler hastalıklarından olan Spinal müsküler atrofi (SMA), Survival of motor neuron 1 (SMN1) genindeki mutasyonlar nedeniyle oluşmakta ve SMN proteini eksikliğinden en fazla motor nöronlar etkilenmektedir. Nöron farklılaşması ve işleyişi için mikrotübül dinamiğinin ve stabilitesinin kontrolü önemli olup SMN eksikliğinde mikrotübül polimerizasyonunun bozulmasına ilişkin mekanizmalar bilinmemektedir. Mikrotübüller nöronlarda akzon ve dendrit yapılarının kurulmasını sağlayan, akzonun ucuna doğru mRNA, protein ve organel transportunda görevli hücre iskeleti elemanlarıdır. Mikrotübül stabilitesinin ve polimerizasyonunun düzenlenmesinde mikrotübül asosiye proteinler (MAP) ve mikrotübülün pozitif ucunda bulunan uç proteinleri (+TIP) görev almaktadır. Pozitif uç proteinlerinden olan EB1 ve EB3 (End Binding Protein) mikrotübülün uzayan ucundaki tübülinlere bağlanarak, pozitif uca bağlanan diğer proteinlerin birbirleriyle ilişki kuracağı moleküler bir platform oluşturmaktadır. MAP proteinlerinden olan MAP1B’nin ise EB proteinlerine bağlanıp sitoplazmada tutulmalarını sağladığı ve mikrotübüle bağlanmalarını engellediği bilinmektedir. Anabilim Dalı’mızda gerçekleştirilen önceki çalışmalarda SMN eksikliğinde MAP1B proteininde saptanan artışın EB proteinlerini etkileyebileceği düşünülerek bu tez çalışmasında, EB1 ve EB3 proteinlerinin ifade ve yerleşimleri motor nöron benzeri NSC34 hücre hattında araştırılmıştır. NSC34 hücrelerinde SMN ifadesi siRNA yöntemi ile baskılanarak in vitro SMA modeli oluşturulmuş EB1 ve EB3 proteinlerinin ifade düzeyi Western blot yöntemi ile analiz edilmiştir. EB1 proteininin NSC34 hücrelerinde endojen ifadesinin bulunmadığı, EB3 proteinin ise SMN eksikliğine bağlı olarak %44 oranında azaldığı saptanmıştır. SMN eksikliğinde EB3 proteinlerinin nörit başlangıcındaki ve ucundaki olası yerleşim değişikliğini araştırmak üzere immünfloresan boyama çalışmaları gerçekleştirilmiş, SMN eksikliğinde nörit başlangıcında EB3 proteinlerinin uzayan mikrotübül ucunda oluşturdukları komet yapılarının sayısında kontrol hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı bir artma, bir kometin mikrotübül üzerinde kapladığı alanda ise azalma saptanmıştır. Kometlerin kapladığı toplam alan, komet floresan yoğunluğu ve toplam (serbest ve mikrotübül ile ilişkili) EB3 floresan yoğunluğunda bir değişiklik saptanmamıştır. Sonuçlarımız, SMN eksikliğinde nöritlerin başlangıç kısmında yerleşim gösteren mikrotübüllerin kontrole göre daha dinamik yapıda olduklarına ve SMA patomekanizmasında EB3 proteinlerinin rolü olabileceğine işaret etmektedir. Bu konuda gerçekleştirilecek ileri araştırmalar ile SMN eksikliğinin mikrotübül dinamiğindeki rolünün açıklanması mümkün olabilecektir.tr_TR
dc.contributor.departmentTıbbi Biyolojitr_TR
dc.embargo.terms6 aytr_TR
dc.embargo.lift2020-02-24T10:44:26Z
dc.identifier.ORCIDhttps://orcid.org/0000-0002-2366-3507tr_TR


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

info:eu-repo/semantics/embargoedAccess
Except where otherwise noted, this item's license is described as info:eu-repo/semantics/embargoedAccess